Mục lục bài họcĐang ở d07-b1
DNA Replication and the Polymerase Chain Reaction
Replication is semi-conservative
Each parental strand acts as a template, so every daughter molecule ends up with one old strand and one new strand. Helicase unwinds the double helix at the replication fork by breaking the hydrogen bonds between complementary bases, and single-strand binding proteins stop the separated strands from re-annealing.
Why one new strand has to lag behind
DNA polymerase III can only add a nucleotide to a free 3' end, so every new strand grows strictly in the 5' to 3' direction. Because the two template strands are antiparallel, only one of them allows continuous synthesis in the same direction as the moving fork.
- The leading strand is built as one unbroken piece, following the fork.
- The lagging strand is built backwards, away from the fork, as a series of short Okazaki fragments.
- Primase lays down a short RNA primer to give polymerase a 3' end to start from; DNA polymerase I replaces each primer with DNA, and DNA ligase seals the remaining nicks in the sugar-phosphate backbone.
PCR repeats the same chemistry in a tube
The polymerase chain reaction cycles between denaturation at about $95\ ^\circ\text{C}$, annealing of primers at about $55\ ^\circ\text{C}$ and extension at about $72\ ^\circ\text{C}$ by Taq polymerase, taken from a bacterium of hot springs so that it survives the heating step. Each cycle doubles the target region, so $n$ cycles multiply the number of copies by $2^n$.
Nhân đôi ADN là bán bảo tồn
Mỗi mạch cũ làm template (mạch khuôn) cho một mạch mới, nên phân tử con nào cũng gồm một mạch cũ cộng một mạch mới — đó chính là nghĩa của semi-conservative replication. Helicase tháo xoắn tại replication fork (chạc ba sao chép) bằng cách cắt liên kết hiđro giữa các cặp base bổ sung.
Cả chương gói trong một câu
DNA polymerase III chỉ gắn được nucleotit vào đầu 3' tự do, tức chỉ kéo dài mạch theo chiều 5' → 3'. Hai mạch khuôn lại antiparallel (ngược chiều nhau), nên chỉ một mạch được tổng hợp cùng hướng với chạc đang chạy:
- leading strand (mạch dẫn đầu) — làm một mạch liền, bám theo chạc.
- lagging strand (mạch theo sau) — làm ngược hướng, quay lưng lại chạc, thành từng Okazaki fragments (đoạn Okazaki) ngắn.
- Primase đặt một mồi ARN ngắn để tạo ra đầu 3' cho polymerase khởi động; DNA polymerase I thay mồi bằng ADN; DNA ligase hàn nốt các khe trên khung đường-photphat.
PCR là chính cơ chế ấy, đặt trong ống nghiệm
Polymerase chain reaction lặp ba bước: biến tính ở khoảng $95\ ^\circ\text{C}$, gắn mồi ở khoảng $55\ ^\circ\text{C}$, kéo dài ở khoảng $72\ ^\circ\text{C}$ nhờ Taq polymerase — enzim lấy từ vi khuẩn suối nước nóng nên không biến tính ở bước đun. Mỗi chu kỳ nhân đôi lượng ADN đích, nên $n$ chu kỳ nhân số bản sao lên $2^n$ lần. Nhớ nhân với số bản sao ban đầu, đừng chỉ ghi $2^n$.
Dùng sơ đồ chạc ba trong bài, giải thích vì sao lagging strand phải tổng hợp thành từng đoạn ngắn, trong khi leading strand làm được một mạch liền. Nêu rõ vai trò của primase và ligase.
Bắt đầu từ ràng buộc của enzim. DNA polymerase III chỉ gắn nucleotit vào đầu 3' tự do, nghĩa là mạch mới chỉ dài ra được theo chiều 5' → 3'. Đây không phải quy ước, mà là hoá học: nhóm $-\text{OH}$ ở vị trí 3' của đường mới là chỗ tạo được liên kết photphodieste với nucleotit tiếp theo.
Ghép ràng buộc đó với hình dạng của chạc. Hai mạch khuôn antiparallel. Trên mạch khuôn phía trên, chiều 5' → 3' của mạch mới trùng với hướng chạc đang mở, nên polymerase cứ bám theo chạc mà chạy — một mạch liền, không nghỉ.
Trên mạch khuôn phía dưới thì ngược: chiều 5' → 3' của mạch mới hướng ra xa chạc. Polymerase chạy được một quãng là hết khuôn đã lộ ra; trong lúc đó chạc lại mở thêm một đoạn khuôn mới ở phía sau lưng nó. Không có cách nào quay đầu, nên tế bào làm cách khác: khởi động lại một đoạn mới ở gần chạc rồi lại chạy ra xa. Kết quả là các Okazaki fragments.
Vai trò hai enzim. Polymerase không tự khởi động được một mạch từ con số không — nó cần sẵn một đầu 3'. Vì vậy primase phải đặt một mồi ARN cho mỗi đoạn Okazaki, nên mạch dưới cần rất nhiều mồi còn mạch trên chỉ cần một. Sau khi DNA polymerase I thay mồi bằng ADN, giữa hai đoạn còn một khe chưa nối trên khung đường-photphat; DNA ligase hàn khe đó để mạch dưới trở thành một mạch liên tục.
Một phản ứng PCR bắt đầu với $6$ bản sao của đoạn ADN đích và chạy $10$ chu kỳ trọn vẹn, hiệu suất coi như $100\%$. Tính số bản sao cuối cùng. Sau đó giải thích vì sao trên thực tế đường cong nhân bản luôn đi ngang ở các chu kỳ cuối.
Tính: mỗi chu kỳ nhân đôi lượng ADN đích, nên sau $10$ chu kỳ số bản sao được nhân lên $2^{10} = 1024$ lần. Với $6$ bản sao ban đầu: $6 \times 1024 = 6144$ bản sao.
Chỗ hay mất điểm là quên nhân với số bản sao ban đầu và chỉ ghi $1024$. Công thức đầy đủ là số cuối $= N_0 \times 2^n$, trong đó $N_0$ là số bản sao ban đầu và $n$ là số chu kỳ.
Vì sao thực tế lại đi ngang. Mô hình $2^n$ giả định mọi thứ đều dư thừa. Sau vài chục chu kỳ, hai thứ cạn: primer và dNTP. Ngoài ra Taq polymerase tuy chịu nhiệt nhưng vẫn mất dần hoạt tính sau mỗi lần đun ở $95\ ^\circ\text{C}$, và lượng sản phẩm quá lớn khiến hai mạch đích tự bắt lại với nhau nhanh hơn là bắt với mồi.
Vì thế đường cong PCR thực có ba đoạn: đoạn nền chưa thấy tín hiệu, đoạn mũ gần đúng $2^n$, rồi đoạn plateau nằm ngang. Định lượng ADN ban đầu phải dựa vào đoạn mũ, không bao giờ dựa vào đoạn plateau — đó chính là lý do người ta đo ở chu kỳ ngưỡng.
Đọc xong rồi — làm thử ngay
Bài tập của chương Theme D1–D2 — DNA Replication, Cell Cycle and Gene Expression gồm 14 câu trắc nghiệm và 4 đề tự luận, ra khó hơn đề thật 30–50%. Đáp án hiện ngay khi chọn, miễn phí.