Mục lục bài họcĐang ở d03-b2
Inhibition, Km and Immobilised Enzymes
$V_{max}$, $K_m$ and what each one tells you
As substrate concentration rises, rate rises steeply at first, then flattens. The plateau is $V_{max}$: every active site is occupied, so the enzyme concentration is now the limiting factor and adding substrate changes nothing. $K_m$ is the substrate concentration that gives exactly half of $V_{max}$. It is a measure of affinity, and it runs the opposite way to intuition: a low $K_m$ means the enzyme reaches half speed at a low substrate concentration, so it binds substrate strongly. A high $K_m$ means weak binding.
Two kinds of inhibitor, told apart by a graph
A competitive inhibitor resembles the substrate and binds reversibly in the active site. Substrate and inhibitor compete, so the effect can be overcome by adding more substrate: $V_{max}$ is unchanged but is reached only at higher substrate concentrations, so $K_m$ increases. A non-competitive inhibitor binds at a different site, changing the shape of the active site. Adding substrate cannot displace it, so $V_{max}$ falls, while $K_m$ is essentially unchanged. Many metabolic pathways are regulated by end-product inhibition, in which the final product acts as a non-competitive inhibitor of an early enzyme, a form of negative feedback.
Immobilised enzymes
Enzymes may be trapped in alginate beads, adsorbed onto an inert surface, cross-linked to one another or covalently bonded to a matrix. The industrial advantages are that the product is not contaminated with enzyme, the enzyme can be recovered and reused, and the enzyme is more stable to heat and pH change because the support holds its tertiary structure together. The cost is that substrate must diffuse to the enzyme, so the measured rate is usually a little lower than for the same enzyme free in solution.
$V_{max}$, $K_m$ và mỗi đại lượng nói lên điều gì
Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ tăng nhanh lúc đầu rồi phẳng dần. Đoạn phẳng là $V_{max}$: mọi active site đều đang có cơ chất, nên yếu tố giới hạn lúc này là nồng độ enzyme, và thêm cơ chất không đổi được gì. $K_m$ là nồng độ cơ chất cho đúng một nửa $V_{max}$. Nó đo ái lực, và nó chạy ngược với trực giác: $K_m$ thấp nghĩa là enzyme đạt nửa tốc độ ngay ở nồng độ cơ chất thấp, tức nó gắn cơ chất chặt. $K_m$ cao nghĩa là gắn lỏng.
Hai loại chất ức chế, phân biệt bằng đúng một đồ thị
Competitive inhibitor có hình dạng giống cơ chất và gắn thuận nghịch vào chính active site. Cơ chất và chất ức chế tranh chỗ, nên thêm thật nhiều cơ chất là thắng lại được: $V_{max}$ không đổi nhưng chỉ đạt được ở nồng độ cơ chất cao hơn, tức $K_m$ tăng. Non-competitive inhibitor gắn ở một vị trí khác, làm active site đổi hình. Thêm cơ chất không đuổi nó đi được, nên $V_{max}$ giảm, còn $K_m$ về cơ bản không đổi. Rất nhiều chuỗi chuyển hoá được điều hoà bằng end-product inhibition: sản phẩm cuối cùng đóng vai chất ức chế không cạnh tranh của một enzyme ở đầu chuỗi — đó là một dạng phản hồi âm.
Enzyme cố định
Enzyme có thể bị nhốt trong hạt alginate, hấp phụ lên bề mặt trơ, nối chéo với nhau, hoặc gắn cộng hoá trị vào giá thể. Lợi ích công nghiệp: sản phẩm không lẫn enzyme, enzyme thu hồi và dùng lại được, và enzyme bền hơn với nhiệt và với thay đổi pH vì giá thể giữ giúp cấu trúc bậc ba. Cái giá phải trả: cơ chất phải khuếch tán tới chỗ enzyme, nên tốc độ đo được thường thấp hơn một chút so với chính enzyme đó ở dạng tự do trong dung dịch.
Bảng cho tốc độ phản ứng của một enzyme ở các nồng độ cơ chất khác nhau.
| nồng độ cơ chất / mmol dm-3 | 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 40 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| tốc độ / µmol s-1 | 16 | 27 | 48 | 64 | 76 | 78 |
Ước lượng $V_{max}$ và $K_m$, rồi cho biết một enzyme khác có $K_m = 2\ \text{mmol dm}^{-3}$ gắn cơ chất chặt hơn hay lỏng hơn.
Bước 1 — ước lượng $V_{max}$. Từ $20$ lên $40\ \text{mmol dm}^{-3}$, tốc độ chỉ nhích từ $76$ lên $78$. Đường cong đã gần như phẳng, nên $V_{max} \approx 80\ \mu\text{mol s}^{-1}$.
Bước 2 — tìm nửa $V_{max}$. Nửa của $80$ là $40\ \mu\text{mol s}^{-1}$.
Bước 3 — đọc ngược sang trục hoành. Tốc độ $40$ nằm giữa $27$ (ở $2$) và $48$ (ở $5$). Nội suy tuyến tính: $2 + (40-27) \div (48-27) \times (5-2) = 2 + 13 \div 21 \times 3 \approx 3{,}9$. Vậy $K_m \approx 4\ \text{mmol dm}^{-3}$.
Bước 4 — so ái lực. Enzyme kia có $K_m = 2$, tức nhỏ hơn. $K_m$ nhỏ nghĩa là chỉ cần nồng độ cơ chất thấp đã đạt nửa tốc độ tối đa, tức enzyme gắn cơ chất chặt hơn, ái lực cao hơn.
Chỗ dễ sai: phải tìm $V_{max}$ trước rồi mới chia đôi. Nhiều bài làm lấy tốc độ lớn nhất trong bảng ($78$) làm $V_{max}$; sai số đó nhỏ ở đây nhưng sẽ lớn nếu bảng dừng sớm, lúc đường cong còn đang lên.
Thêm chất $X$ vào phản ứng thì tốc độ giảm; nhưng khi tăng nồng độ cơ chất lên rất cao, tốc độ leo trở lại đúng mức $V_{max}$ cũ. Thêm chất $Y$ thì tốc độ giảm và không bao giờ trở lại $V_{max}$ cũ dù cơ chất bao nhiêu. Xác định loại ức chế của mỗi chất và giải thích bằng cơ chế.
Chất $X$ là chất ức chế cạnh tranh. Bằng chứng quyết định là $V_{max}$ được phục hồi. Điều đó chỉ xảy ra khi cơ chất và chất ức chế tranh cùng một chỗ: khi cơ chất áp đảo về số lượng, xác suất một active site bắt được cơ chất thay vì bắt chất ức chế tiến gần tới $1$.
Cơ chế: $X$ có hình dạng giống cơ chất nên vào vừa active site, nhưng không bị biến đổi thành sản phẩm, nên nó chỉ chiếm chỗ rồi rời đi. Hệ quả trên đồ thị: $V_{max}$ giữ nguyên, $K_m$ tăng.
Chất $Y$ là chất ức chế không cạnh tranh. Vì trần tốc độ bị hạ hẳn nên phải có một phần enzyme vĩnh viễn không làm việc được ở nồng độ chất ức chế đó, bất kể có bao nhiêu cơ chất.
Cơ chế: $Y$ gắn vào một vị trí khác active site, thường gọi là vị trí dị lập thể. Việc gắn đó làm đổi cấu trúc bậc ba, kéo theo active site đổi hình nên không còn bổ trợ với cơ chất. Cơ chất không thể đuổi $Y$ đi vì hai bên không tranh cùng một chỗ. Hệ quả trên đồ thị: $V_{max}$ giảm, $K_m$ gần như không đổi.
Ứng dụng phải nhớ: ức chế không cạnh tranh chính là cơ chế của end-product inhibition — sản phẩm cuối chuỗi quay lại tắt bớt enzyme đầu chuỗi, đúng nghĩa một vòng phản hồi âm.
Đọc xong rồi — làm thử ngay
Bài tập của chương Enzymes gồm 14 câu trắc nghiệm và 3 đề tự luận. Đáp án hiện ngay khi chọn, miễn phí.